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Macrophages巨噬細胞的體外極化誘導(dǎo)

更新時間:2022-06-11   點擊次數(shù):5583次

巨噬細胞是造血系統(tǒng)中*可塑性的細胞,存在于所有組織中,具有豐富的功能多樣性。巨噬細胞參與細胞碎片和病原體的識別、吞噬和降解,并且在向T細胞提呈抗原以及誘導(dǎo)其他抗原呈遞細胞表達共刺激分子等方面發(fā)揮作用,從而啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

除此之外,巨噬細胞還在維持組織穩(wěn)態(tài)以及組織的修復(fù)和重塑方面發(fā)揮作用。當(dāng)遇到不同的抗原刺激時,單核細胞會變成高度殺傷性的巨噬細胞(M1),或變成免疫抑制性的巨噬細胞(M2)。

巨噬細胞極化.jpg

實驗前準(zhǔn)備

耗材準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備
1、細胞培養(yǎng)板/皿2、細胞計數(shù)儀3、移液槍、槍頭1. 細胞誘導(dǎo)因子 2. 消化酶3. 無菌PBS4. 培養(yǎng)基、血清5. 流式抗體


一、THP-1細胞的極化

1) THP-1細胞鋪板,將佛波酯PMA(100 ng/ml)加入*培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)其向巨噬細胞的成熟;

2) 48小時后THP-1細胞成熟為巨噬細胞,外觀圓形高折光,從懸浮狀態(tài)快速變成貼壁狀態(tài);

3) 將成熟的巨噬細胞消化下來(Accutase酶消化:專門用于消化貼壁細胞),重新鋪板,誘導(dǎo)向M1-like、M2-like的極化。

4) 與IFN-γ(20 ng/ml)和LPS(100 ng/ml)孵育48小時以上,使其向M1極化。

與IL-4(20 ng/ml)和IL-13(20 ng/ml)孵育48小時以上,使其向M2極化。

5) 極化完成后,細胞用不含刺激物的無血清RPMI重懸,可保持72小時。


二、單核細胞來源巨噬MDM

1) 將單核細胞以5×105/ml的濃度接種在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,同時加入20 nM的CSF-1。

2) 單個核細胞在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)7天,每3天更換一次培養(yǎng)液,獲得MDM。

3) MDM得到之后,去除原培養(yǎng)基,更換新的培養(yǎng)基。

4) 若與新鮮的、無血清的RPMI繼續(xù)培養(yǎng),則維持M0狀態(tài)。

5) 與LPS(1 μg/ml)和IFN-γ(10 ng/ml)孵育48小時,則向M1極化。

與IL-4(20 ng/ml)和IL-13(5 ng/ml)孵育48小時,則向M2表型極化。

6) 極化完成后,細胞用不含刺激物的無血清RPMI重懸,可保持72小時。


三、骨髓來源巨噬細胞BMDM

1) 將分離的骨髓細胞以2×106/ml的濃度接種在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基中,同時加入10 ng/ml M-CSF。

2) 在第3天更換新鮮的BMDM生長培養(yǎng)基。

3) 第7天,熒光團偶聯(lián)抗體染色,用流式細胞術(shù)檢測表達CD11b和F4/80的細胞來評估成熟BMDM的形成。

4) 第7天,成熟BMDM的形成后改為新鮮刺激培養(yǎng)基。

5) 與100 ng/ml LPS或含有50 ng/ml IFNγ的100 ng/ml LPS共孵育,則向M1極化。

與10 ng/ml IL-4和/或10 ng/ml IL-13共孵育,則向M2極化。

6) 用0.05%的胰蛋白酶將受刺激的細胞從培養(yǎng)皿中分離出來,然后用含有10%胎牛血清的PBS洗滌細胞兩次。


四、RAW264.7細胞極化

1) 將RAW264.7細胞重懸在含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。

2) 將傳至2-5代的細胞作為后續(xù)實驗使用。

3) 并將培養(yǎng)基換成不含胎牛血清的*培養(yǎng)基。

4) 與100 ng/ml LPS共孵育,則向M1極化。

與20 ng/ml IL-4(可添加20 ng/ml IL-10)共孵育,則向M2極化。


下表為對以上4種細胞誘導(dǎo)試劑進行的簡要匯總

細胞培養(yǎng)基初始加入
THP-1細胞RPMI 1640100ng/ml PMA
單核細胞來源巨噬MDMRPMI 164020 nM CSF-1
骨髓來源巨噬細胞BMDMIMDM10ng/ml M-CSF
RAW264.7細胞DMEM/
M1極化M2極化
20ng/ml IFN-γ100ng/ml LPS20 ng/ml IL-420 ng/ml IL-13
1μg/ml LPS10ng/ml IFN-γ20 ng/ml IL-45 ng/ml IL-13
100ng/ml LPS(可加50 ng/ml IFNγ)10 ng/ml IL-4(可加10 ng/ml IL-13)
100ng/ml LPS20ng/ml IL-4(可加20ng/ml IL-10)


參考文獻:

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