ClickChemistry點(diǎn)擊化學(xué)的反應(yīng)類型和常見應(yīng)用

緊隨點(diǎn)擊化學(xué)概念的提出，一價(jià)銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(yīng)在2002年被Sharpless和Medal組分別獨(dú)立報(bào)道。該反應(yīng)可謂點(diǎn)擊化學(xué)中的第一個(gè)經(jīng)典之作。疊氮和端炔在絕大多數(shù)化學(xué)條件下保持穩(wěn)定，卻可以在一價(jià)銅催化條件下，高效專一地轉(zhuǎn)換為1，3-取代的三氮唑 (式1) 。與其結(jié)構(gòu)一致的鏈接基團(tuán)在自然界中尚未被發(fā)現(xiàn)，但條件溫和、產(chǎn)率高、具有很高的化學(xué)選擇性且不受水氧干擾等特點(diǎn)成為該反應(yīng)的突出優(yōu)勢。

2. 應(yīng)變促進(jìn)的疊氮-炔點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng) (SPAAC)

Bertozzi等人于2004年開發(fā)出了應(yīng)變促進(jìn)疊氮-炔烴的環(huán)化加成反應(yīng)(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition, SPAAC)，它不需要使用金屬催化劑、還原劑或穩(wěn)定配體。相反，該反應(yīng)利用環(huán)應(yīng)變成為環(huán)辛炔（例如OCT、BCN、DBCO、DIBO和DIFO）釋放的焓形成穩(wěn)定的三唑（式2）。盡管SPAAC的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)比CuAAC慢，但它在活細(xì)胞中的生物相容性是毫無疑問的。迄今為止，該反應(yīng)已廣泛應(yīng)用于雜化和嵌段聚合物形成、代謝工程、納米粒子功能化、寡核苷酸標(biāo)記等領(lǐng)域。

3. 四嗪和烯烴（反式環(huán)辛烯）之間的連接

反式環(huán)辛烯TCO在逆電子需求狄爾斯阿爾德 (IEDDA) 中反應(yīng)，在生理?xiàng)l件下的反應(yīng)具有無需催化劑、反應(yīng)速率快和生物相容性好的特點(diǎn)。反式環(huán)辛烯被廣泛應(yīng)用于生物和材料科學(xué)的研究中，尤其是靶向醫(yī)學(xué)成像或治療的預(yù)靶向方法和相關(guān)的試劑盒。四嗪Tetrazine是一類含有反應(yīng)性四嗪基團(tuán)的點(diǎn)擊化學(xué)標(biāo)記試劑，含有四個(gè)氮原子的六元雜環(huán)化合物，有三種異構(gòu)體：1,2,3,4-四嗪、1,2,4,5-四嗪、1,2,3,5-四嗪。四嗪試劑與TCO（反式環(huán)辛烯）在逆電子需求 Diels Alder 反應(yīng)和逆 Diels Alder 反應(yīng)中具有高反應(yīng)性以消除氮?dú)?。這是在標(biāo)記活細(xì)胞、分子成像和其他生物偶聯(lián)應(yīng)用中以低濃度進(jìn)行生物偶聯(lián)的非?？焖俚姆磻?yīng)。

（1）反應(yīng)模塊化，如疊氮和炔基都能生成三唑類化合物；

（2）原料易得、適用范圍廣；

（3）反應(yīng)收率高，區(qū)域與立體選擇性好；

（4）操作簡單，反應(yīng)條件溫和、不怕水和氧；

（5）產(chǎn)物易分離提純，重結(jié)晶或蒸餾即可分離，無需層析柱分離；

（6）絕大部分反應(yīng)涉及碳-雜原子(主要是氮 ,氧,硫)鍵的形成；

（7）反應(yīng)需要高的熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力（>84kJ/mol）；

（8）點(diǎn)擊反應(yīng)一般為化合（無副產(chǎn)物）或縮合反應(yīng)（產(chǎn)物為水等小分子） 。

1. 藥物方面

Buckle等的研究顯示，三唑類衍生物是強(qiáng)有力的抗皮膚過敏性藥物，以小白鼠作為受體，顯示了良好的藥物活性。1，2，3-三唑取代的苯磺酰胺類化合物是人類β-腎上腺激素受體很強(qiáng)的選擇性收縮劑，藥理篩選實(shí)驗(yàn)證明，其同系物是具有非凡作用。具有選擇性的小分子抗凝藥替卡格雷是一種1，2，3-三氮唑衍生物，該藥能可逆性作用于血管平滑肌細(xì)胞上的嘌呤亞型P2Ym對ADP引起的血小板聚集有明顯的抑制作用且口服使用后起效迅速，因此能有效改善急性冠心病患者的癥狀。

2. 先導(dǎo)化合物庫的合成

直接使用點(diǎn)擊組件模塊庫的構(gòu)建過程對于新型分子藥物的快速組合合成是非常理想的，可以極大縮短先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化所需的時(shí)間。利用一些短的反應(yīng)序列，點(diǎn)擊化學(xué)可以在實(shí)驗(yàn)室大量制備結(jié)構(gòu)復(fù)雜、新穎，并具有多樣性的化合物庫，如l，2-二取代乙烷衍生物庫、五元芳雜環(huán)化合物庫、1，2．3-三唑衍生物庫和非芳雜環(huán)化合物庫等。如Khanetskyy等哈成了包含有27個(gè)嘧啶酮為基本骨架的化合物庫。反應(yīng)過程包括：甲基溴化，疊氮化，偶極環(huán)加成反應(yīng)成環(huán)。反應(yīng)中多步運(yùn)用微波促進(jìn)技術(shù)；并利用cu(D催化最后的成環(huán)反應(yīng)，得到了較好的結(jié)果。

3. 靶標(biāo)導(dǎo)向的活性小分子合成

應(yīng)用靶標(biāo)導(dǎo)(target-guided)的點(diǎn)擊化學(xué)可以發(fā)現(xiàn)高親和力的抑制劑，結(jié)構(gòu)合適的疊氮基化合物與炔基化合物在酶活性中心的催化下能快速的生成立體專一的三氮唑化合物，合成酶自身的抑制劑。Sharpless等利用用生理?xiàng)l件下惰性的反應(yīng)物，進(jìn)行不可逆的靶標(biāo)導(dǎo)向合成，得到高親和性的AChE抑制劑。

4. 糖蛋白

糖蛋白在生物制藥領(lǐng)域有著非常重要的地位，通常糖蛋白包含以N或O方式與蛋白質(zhì)連接的寡糖，但糖肽鍵對酶水解非常敏感，限制了其新陳代謝的穩(wěn)定性。此外，由于糖基部分的消除容易抑制O-糖蛋白的合成組裝。點(diǎn)擊化學(xué)能克服合成和新陳代謝的不穩(wěn)定性，因此將點(diǎn)擊化學(xué)用于糖蛋白的合成非常適合Rutjes等用疊氮氨基酸和炔基配糖通過點(diǎn)擊反應(yīng)在溫和的條件下合成了三唑糖氨基酸，且產(chǎn)率較高。Macmillan和Blanc對半胱氨酸硫醇進(jìn)行化學(xué)選擇性的炔基團(tuán)取代，清楚表明了點(diǎn)擊化學(xué)和自然化學(xué)連接(native chemical strategy)的兼容性。Westermann等將點(diǎn)擊化學(xué)與關(guān)環(huán)轉(zhuǎn)換反應(yīng)(ring closing metathesis)相結(jié)合制備了大環(huán)糖脂模擬庫。

5. 生物探針和微陣列

功能化的平面在當(dāng)今生物技術(shù)中起到重要的作用，例如在糖、DNA或蛋白質(zhì)微陣列、生物傳感器或微流體設(shè)備中的應(yīng)用；而高效的三唑連接非常適合于修飾有機(jī)或無機(jī)表面，因此近年來許多用于修飾基片平面的點(diǎn)擊化學(xué)方法被大量報(bào)道。糖陣列是用于篩選血凝素蛋白的高效能手段。Wong課題組最早使用點(diǎn)擊化學(xué)構(gòu)建糖基微陣列，其目的是開發(fā)一種可實(shí)現(xiàn)的、高效能的篩選方法，用于類似血凝素蛋白質(zhì)的識別。其中，疊氮基團(tuán)修飾的半乳糖在室溫下通過CuI／DIPEA催化與疏水的丙烯酰胺發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，然后丙烯酰胺再以非共價(jià)鍵的方式附于聚苯乙烯載體上。實(shí)驗(yàn)表明綁定了D-半乳糖苷的蓖麻蛋白B血凝素蛋白能成功地被糖陣列篩選。Wong課題組還報(bào)道了一種使用點(diǎn)擊化學(xué)作為主要固定途徑的非共價(jià)鍵糖陣列，它可以用于Fuc-T抑制劑的高效能篩選。為開發(fā)更穩(wěn)定的高效能篩選方案。

6. 免疫熒光檢測

孫丹等報(bào)道了一種新型免疫熒光標(biāo)記方法及其在細(xì)胞熒光檢測中的用。首先，合成了2個(gè)關(guān)鍵的化合物6-疊氮-己酸琥珀酰亞胺活性酯和4-乙炔基一Ⅳ-乙基-1，8-萘酰亞胺，并將合成的6-疊氮-己酸琥珀酰亞胺活性酯與抗her2抗體Anti—HPl5的游離氨基偶聯(lián)獲得疊氮化IgG；隨后通過銅離子化4-乙炔基-N-乙基-1，8-萘酰亞胺中的炔基與標(biāo)記抗體的疊氮基團(tuán)進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)以NHS-FITC和NHS-Rhodamine標(biāo)記的抗體為陽性對照，測定了該標(biāo)記方法的靈敏度，結(jié)果與陽性對照相當(dāng)。然后，在細(xì)胞水平上進(jìn)行染色其檢出限可達(dá)0.1μg，結(jié)果表明，疊氮標(biāo)記抗體可有效應(yīng)用于免疫熒光染色分析。最后，采用激光共聚焦三通道復(fù)合熒光分析法對不同標(biāo)記方法及其對應(yīng)的免疫熒光顯色方法進(jìn)行了研究，確認(rèn)采用本文方法標(biāo)記的抗體可與其它免疫熒光技術(shù)同時(shí)使用，且結(jié)果互不干擾。本研究通過開發(fā)一種新型的抗體標(biāo)記技術(shù)，建立了一種新的免疫熒光抗體分析方法，并在細(xì)胞水平上進(jìn)行了應(yīng)用驗(yàn)證，豐富了免疫熒光抗體檢測手段。該方法在未來的免疫研究中具備發(fā)展?jié)摿蛷V泛的應(yīng)用前景。