Cell:15種巨噬細(xì)胞亞型在人類產(chǎn)前的時(shí)空動(dòng)態(tài)圖譜

2023年9月12日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院李漢杰課題組聯(lián)合深圳市寶安區(qū)婦幼保健院、深圳大學(xué)、上海交通大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)等單位在Cell（IF=57.49）發(fā)表了研究論文：An immune cell atlas reveals the dynamics of human macrophage specification during prenatal development。 該研究通過構(gòu)建人類產(chǎn)前免疫細(xì)胞發(fā)育的時(shí)空動(dòng)態(tài)圖譜，揭示了多種巨噬細(xì)胞亞型在發(fā)育過程中的分化起源、空間定位、功能特征及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

重大貢獻(xiàn)：

1. 突破性的發(fā)現(xiàn)了一群在轉(zhuǎn)錄組、特征蛋白表達(dá)、和形態(tài)上與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞類似且存在于皮膚、睪丸和心臟中的類小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia-like cells）。它們是早期表皮中的主要免疫細(xì)胞群，沿背-側(cè)-腹軸呈極化分布。這群類小膠質(zhì)細(xì)胞可以與神經(jīng)嵴細(xì)胞相互作用，并調(diào)節(jié)其向黑色素細(xì)胞的分化。

2. 清晰的鑒定了一群廣泛分布的促血管生成巨噬細(xì)胞（Proangiogenic macrophages, PraM），它們駐留在多個(gè)器官的血管周圍。這些促血管生成巨噬細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞均從起源于卵黃囊的巨噬細(xì)胞前體分化而來。

3. 構(gòu)建了橫跨「18個(gè)發(fā)育階段」、「19種組織」的人類胚胎免疫系統(tǒng)發(fā)育高分辨率圖譜。為研究人類巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性和發(fā)育提供了一個(gè)高分辨率的時(shí)空動(dòng)態(tài)圖譜，有助于理解其在發(fā)育過程中的不同作用。研究團(tuán)隊(duì)還開發(fā)了一個(gè)專門的數(shù)據(jù)庫（119.8.233.169），方便共享數(shù)據(jù)，促進(jìn)研究成果的共同探索和領(lǐng)域發(fā)展。

巨噬細(xì)胞幾乎分布于全身每一個(gè)部位。巨噬細(xì)胞高度異質(zhì)性，主要表現(xiàn)在形態(tài)、定位、基因表達(dá)譜及功能等方面，這些表型由巨噬細(xì)胞的發(fā)育起源（先天）和駐留的微環(huán)境所（后天）決定。具有組織特異性特征的巨噬細(xì)胞包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia）、肝臟的枯否細(xì)胞（Kupffer cells）和表皮的朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cells）等。還有一些分布于多個(gè)器官的巨噬細(xì)胞，如血管周圍巨噬細(xì)胞（Perivascular macrophages）?；趪X類動(dòng)物（尤其小鼠）的研究結(jié)果，學(xué)術(shù)界對巨噬細(xì)胞亞型的多樣性、發(fā)育起源以及組織特異性的形成有了一定的共識。但是，這些發(fā)現(xiàn)是否適用于人類仍是一個(gè)未知數(shù)。

研究團(tuán)隊(duì)對來自受孕后4-26 PCW（Postconceptional Week，PCW）囊括19種人類胚胎組織樣本的免疫細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了近30萬個(gè)高質(zhì)量的免疫細(xì)胞(見下圖)，并鑒定了11種主要的免疫細(xì)胞類型，包括：巨噬細(xì)胞（Macrophages）、祖細(xì)胞（Progenitor cells）、B 淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、先天淋巴細(xì)胞（Innate-like lymphocytes）、自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cells）、樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells）、單核細(xì)胞（Monocytes）、巨核細(xì)胞（Megakaryocytes）、粒細(xì)胞（Granulocytes）和紅細(xì)胞（Erythrocytes）。在此基礎(chǔ)之上，研究團(tuán)隊(duì)對每一種主要的免疫細(xì)胞類型進(jìn)行了更細(xì)致的分類，最終注釋得到56種免疫細(xì)胞亞型。

研究人員重點(diǎn)對巨噬細(xì)胞進(jìn)行了研究并將其進(jìn)一步細(xì)分為了15個(gè)亞群。通過時(shí)空分析，他們發(fā)現(xiàn)在人類胚胎發(fā)育時(shí)期，巨噬細(xì)胞就已經(jīng)具有了顯著的組織特異性。在4 PCW左右（器官初形成階段），巨噬細(xì)胞前體就已經(jīng)出現(xiàn)在胚胎以及卵黃囊中并一直持續(xù)到大概8 PCW，直到被成熟的組織駐留巨噬細(xì)胞所替代。在這些巨噬細(xì)胞中，一部分亞型具有顯著的組織特異性特征，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞，肝臟中的枯否細(xì)胞、表皮中的朗格漢斯細(xì)胞等。而另外一部分亞型共享于多個(gè)組織中，如促血管生成巨噬細(xì)胞以及其前體細(xì)胞（pre-Proangiogenic macrophages, pre-PraM）。研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)腎上腺中有一群組織駐留巨噬細(xì)胞（AXL+, FCGR3A+），睪丸中也存在一群組織駐留巨噬細(xì)胞（MMP9+）和一群具有破骨細(xì)胞特征的巨噬細(xì)胞（ACP9+, SIGLEC15+, MMP9+）。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外的類小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia-like cells）

研究人員在胚胎多個(gè)外周組織（皮膚、心臟及睪丸）中鑒定出一群和小膠質(zhì)細(xì)胞有相似基因表達(dá)譜特征的巨噬細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)打破小膠質(zhì)細(xì)胞只存在于腦及脊髓中的傳統(tǒng)認(rèn)知。這群細(xì)胞高表達(dá)P2RY12, TMEM119, SALL1, C3等和小膠質(zhì)細(xì)胞相同的特征基因，并且在無監(jiān)督聚類分析中，這群細(xì)胞也和腦、脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞聚為一類。研究人員因此將這群新發(fā)現(xiàn)的分布在多個(gè)外周組織的細(xì)胞命名為類小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia-like cells）。流式分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這群外周組織中的類小膠質(zhì)細(xì)胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞一樣，都呈現(xiàn)CD45lowP2RY12+MRC1-的表型。此外，基于多重免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)類小膠質(zhì)細(xì)胞在Carnegie Stages 12（CS12）時(shí)期就已經(jīng)出現(xiàn)在表皮組織中。在14 PCW之前，類小膠質(zhì)細(xì)胞一直是表皮中最主要的免疫細(xì)胞，此后細(xì)胞比例才開始逐漸減少，在20 PCW之后，基本被朗格漢斯細(xì)胞替代。在胚胎心臟中，類小膠質(zhì)細(xì)胞最早出現(xiàn)在CS13的主動(dòng)脈（aorta）中，并且在26 PCW之前一直是主動(dòng)脈中最主要的免疫細(xì)胞。而成人主動(dòng)脈組織中則檢測不到這群類小膠質(zhì)細(xì)胞。在胚胎睪丸中，類小膠質(zhì)細(xì)胞最早能夠在CS14的時(shí)候被檢測到，主要存在于附睪（epididymis）中的輸出小管（efferent duct）周圍，而在睪丸實(shí)質(zhì)（parenchyma）中比例則較低（圖2）。

表皮和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均起源于外胚層，而主動(dòng)脈和附睪則起源于主動(dòng)脈-性腺-中腎（aorta-gonad-mesonephros, AGM）區(qū)域。研究團(tuán)隊(duì)推測，小膠質(zhì)細(xì)胞以及類小膠質(zhì)細(xì)胞的前體從卵黃囊遷移到外胚層和 AGM 區(qū)域，隨后在這兩個(gè)區(qū)域獨(dú)立分化為小膠質(zhì)細(xì)胞或類小膠質(zhì)細(xì)胞。

表皮駐留的類小膠質(zhì)細(xì)胞呈極化分布，與神經(jīng)嵴細(xì)胞互作并調(diào)控其分化

由于類小膠質(zhì)細(xì)胞在表皮中最為豐富，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究了它們在表皮組織中的功能。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，與四肢和腹部皮膚相比，類小膠質(zhì)細(xì)胞在背部和頭部表皮中比例更高。在9 PCW時(shí)，背部表皮中幾乎所有的免疫細(xì)胞都是類小膠質(zhì)細(xì)胞，而四肢表皮中約60%的免疫細(xì)胞是類小膠質(zhì)細(xì)胞。進(jìn)一步定量分析表明，在胚胎發(fā)育不同階段，背部表皮的類小膠質(zhì)細(xì)胞都比四肢表皮更多，分布更密集（圖3）。

類小膠質(zhì)細(xì)胞在表皮中的極化分布模式與神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cells， NCCs）的背外側(cè)遷移路線（dorsolateral migration）有類似之處，因此研究人員猜測表皮的類小膠質(zhì)細(xì)胞與NCCs之間可能存在某種互作。NCCs是外胚層衍生的多能干細(xì)胞，背外側(cè)遷移時(shí)可分化為黑色素細(xì)胞（melanocytes）。通過多重免疫熒光實(shí)驗(yàn)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)表皮中的類小膠質(zhì)細(xì)胞和NCCs之間存在直接的相互作用。與之一致的是，研究團(tuán)隊(duì)觀察到類小膠質(zhì)細(xì)胞和黑色素母細(xì)胞（melanoblasts）的密度在不同發(fā)育階段沿表皮的背-側(cè)-腹軸（dorsal-lateral-ventral axis）逐漸降低。

為了評估類小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)嵴細(xì)胞分化的影響，研究團(tuán)隊(duì)體外培養(yǎng)了來源于胚胎背部的新鮮皮膚組織塊。在胚胎皮膚中用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體巨噬細(xì)胞清除劑Clodronate Liposomes清除類小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia-like cells）顯著減少了黑色素母細(xì)胞的數(shù)量，這提示了類小膠質(zhì)細(xì)胞可能會(huì)調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞向黑色素細(xì)胞的分化（圖3）。

廣泛分布于多個(gè)臟器中的促血管生成巨噬細(xì)胞

研究人員在多個(gè)臟器中都鑒定到了一群高表達(dá)促血管生成基因（VEGFA, TNF, IL1B, CXCL8/IL8）的巨噬細(xì)胞，并且這群細(xì)胞在不同組織中都具有相似的基因表達(dá)譜。體外成管實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這群細(xì)胞促血管生成的功能。他們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這群細(xì)胞在各個(gè)臟器中都富集在血管周圍（圖4）。

研究團(tuán)隊(duì)又進(jìn)一步分析了這群促血管生成巨噬細(xì)胞的發(fā)育起源。通過多種擬時(shí)序分析算法推斷這群細(xì)胞是從卵黃囊起源的巨噬細(xì)胞前體分化而來，并且中間經(jīng)歷了一個(gè)相對不成熟的前體狀態(tài)（pre-PraM）。擬時(shí)序分析推算出的分化軌跡與細(xì)胞的真實(shí)采樣時(shí)間高度一致，并且其促血管生成信號也在隨之增強(qiáng)。此外，研究團(tuán)隊(duì)用成管的內(nèi)皮細(xì)胞上清液培養(yǎng)來源于卵黃囊的早期巨噬細(xì)胞前體，發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)出表達(dá)促血管生成基因的巨噬細(xì)胞。這些結(jié)果明確了這群促血管生成巨噬細(xì)胞的發(fā)育起源。

總而言之，該研究通過對人類產(chǎn)前階段近30萬個(gè)免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，著重描繪了15種巨噬細(xì)胞亞型的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化。突破性的發(fā)現(xiàn)了一群在轉(zhuǎn)錄組、特征蛋白表達(dá)、和形態(tài)上與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞類似且存在于皮膚、睪丸和心臟中的類小膠質(zhì)細(xì)胞。它們是早期表皮中的主要免疫細(xì)胞群，沿背-側(cè)-腹軸呈極化分布。這群類小膠質(zhì)細(xì)胞可以與神經(jīng)嵴細(xì)胞相互作用，并調(diào)節(jié)其向黑色素細(xì)胞的分化。通過功能、空間特征、分化軌跡的研究，研究團(tuán)隊(duì)還細(xì)致解析了一種尚未被充分了解的促血管生成巨噬細(xì)胞，它們駐留在多個(gè)器官的血管周圍。這些促血管生成巨噬細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞均從起源于卵黃囊的巨噬細(xì)胞前體分化而來（圖5）。該文章為研究人類巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性和發(fā)育提供了一個(gè)高分辨率的時(shí)空動(dòng)態(tài)圖譜，有助于理解其在發(fā)育過程中的不同作用。