腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓巨噬細(xì)胞的分離提取和誘導(dǎo)極化

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成分，具有抗感染、抗腫瘤和參與免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和炎癥的重要對(duì)象。

巨噬細(xì)胞的極化

　　巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性和多樣性，可在不同的組織微環(huán)境和生理病理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)化為不同的表型，稱為巨噬細(xì)胞的極化。

　　巨噬細(xì)胞組織分布多樣性和異質(zhì)性的特點(diǎn)，使之一直以來(lái)都是科研工作者們熱門研究的對(duì)象。

　　根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記分子、細(xì)胞因子分泌及代謝相關(guān)基因特征，巨噬細(xì)胞通常被分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞（促炎）和選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞（抗炎）。

　　■ M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)MHC II、CD80、CD86和 CD16/32，分泌TNF-α、IL-6和IL-12等促炎因子，以及CXCL9、CXCL10和CXCL11等趨化因子。

　　■ 另外，M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)arginase-1(Arg1)和CD206，分泌抗炎因子IL-10以及CCL2、CCL17和CCL22等趨化因子。

　　巨噬細(xì)胞極化的體外研究，通常使用脂多糖（LPS）和干擾素（IFN-γ）等TLR激動(dòng)劑誘導(dǎo)M1型極化，使用IL-4或IL-13等誘導(dǎo)M2型極化，然后記錄基因表達(dá)、細(xì)胞表面標(biāo)志物及蛋白質(zhì)含量和活性的變化。

　　原代小鼠巨噬細(xì)胞可以從多個(gè)部位獲得：比如骨髓、腹腔、肺或脂肪組織等。目前巨噬細(xì)胞的分離的方法主要包括貼壁篩選法、密度梯度離心法、酶消化法、流式細(xì)胞儀分離法等。

　　下面具體介紹小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的提取和分離。

腹腔巨噬細(xì)胞提取

　　巨噬細(xì)胞天然存在于小鼠腹腔，腹腔巨噬細(xì)胞多游離存在于腹水中易于獲得：用生理鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗腹腔后抽取腹腔灌洗液體，即可獲取其中的巨噬細(xì)胞。

　　以下為具體實(shí)驗(yàn)方案：

（1）巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)

　　在實(shí)驗(yàn)前3天，連續(xù)3天給小鼠腹腔注射1mL的3%巰基乙酸鹽肉湯，每天1次。（肉湯刺激是非感染性炎癥刺激，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的聚集）

　　注：

　　■ 腹腔注射是關(guān)鍵，給肉湯時(shí)記得回抽，切記不能刺到器官導(dǎo)致小鼠腹腔出血，否則會(huì)使提取的巨噬細(xì)胞不純。

　　■ 硫乙醇酸鹽的作用是將巨噬細(xì)胞由外周血中釋放入腹腔中，可提取更多的巨噬細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，腹腔巨噬細(xì)胞多為M1促炎型。

（2）3天后，收集巨噬細(xì)胞

　?、?處死小鼠

　　準(zhǔn)備75%乙醇，小鼠麻醉后，以脫頸方式處死小鼠，將小鼠置于75%乙醇中浸泡3-5min進(jìn)行滅菌消毒處理后（注：使小鼠的腹腔朝下浸沒在酒精中），移入超凈臺(tái)，仰臥位固定小鼠。

　?、?暴露腹膜

　　將小鼠外皮拉起，沿腹部剪開一個(gè)小口（注意勿將腹膜剪破），再剪開整個(gè)腹部皮膚，捏住兩側(cè)皮膚慢慢向兩邊撕開，使腹膜暴露。

　?、?向腹腔注射生理鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)基：

　　于右下腹部將5mL預(yù)冷的PBS（或5mL預(yù)冷的10%血清RPMI-1640培養(yǎng)液）緩緩注入腹腔（注意不要抽進(jìn)空氣），輕揉小鼠腹部數(shù)次，靜置3-5min，使液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)。

　　注：

　　■ 腹腔注射直接會(huì)接觸表皮，易污染，此步驟需要多加注意。

　　■ 腹腔注射培養(yǎng)基后，按壓動(dòng)作要輕柔緩慢，以防培養(yǎng)基從針孔溢出。

　?、?抽取腹腔液，轉(zhuǎn)移至離心管中（反復(fù)沖洗腹膜腔灌洗液2次）。

（3）巨噬細(xì)胞的純化與培養(yǎng)

　　將收集的腹腔灌洗液于常溫條件下1000r /min 離心5min，棄去上清，所得細(xì)胞沉淀用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸接種，培養(yǎng)體系于37℃靜置培養(yǎng)2～3h后，洗去未貼壁細(xì)胞，余下的貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞。

　　注：由于腹腔巨噬細(xì)胞的粘附能力不強(qiáng)，清洗的時(shí)候動(dòng)作要盡可能輕。

注意事項(xiàng)

　　■ 小鼠腹腔注射刺激物時(shí)不要刺破內(nèi)臟，可以在操作過(guò)程中將小鼠頭部向下抓取，使其腹部?jī)?nèi)容物滑向膈下以避開注射器針頭；

　　■ 若回收的小鼠腹腔灌洗液過(guò)少，可另外注入預(yù)冷的PBS重復(fù)灌洗；

　　■ 若不小心致腹腔出血，可在腹腔液離心后重懸時(shí)加入5倍細(xì)胞懸液體積的紅細(xì)胞裂解液，再次離心棄上層紅色液體。

　　■ 盡量避免被小鼠咬傷或吸過(guò)小鼠腹腔液的針頭扎傷，一旦被咬傷或扎傷，要到專門機(jī)構(gòu)盡快注射出血熱疫苗，如果創(chuàng)面大，需同時(shí)注射破傷風(fēng)疫苗。

骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的提取

　　在原代巨噬細(xì)胞的獲取中，直接分離的腹腔巨噬細(xì)胞（或者肺泡巨噬細(xì)胞）數(shù)量有限，在未經(jīng)誘導(dǎo)時(shí)，每只小鼠只能獲取1.5-3×106個(gè)腹腔巨噬細(xì)胞，不能滿足某些實(shí)驗(yàn)的需求，因此骨髓誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞（Bone marrow-derived macrophages，BMDM）是目前實(shí)驗(yàn)室常用的分離小鼠巨噬細(xì)胞的選擇。

　　以下為具體實(shí)驗(yàn)方案：

（1）誘導(dǎo)因子的獲取

　　M-CSF是一種誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子，獲取的途徑有兩種：

　　1）找商業(yè)化的細(xì)胞因子產(chǎn)品直接購(gòu)買，但不同廠家的細(xì)胞因子活性差異較大，需仔細(xì)甄別。M-CSF的使用濃度在20-50ng/mL即可。

　　2）自己培養(yǎng)能夠分泌這種細(xì)胞因子的細(xì)胞，其中L929細(xì)胞上清含有較高活性M-GSF以及其它多種細(xì)胞因子，比如VEGF、MCP-1、MIG、IL-9/10等。該培養(yǎng)體系可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量巨噬細(xì)胞樣的細(xì)胞，并且該體系不適合其它細(xì)胞生長(zhǎng)，因而其它各系細(xì)胞會(huì)逐步死亡，經(jīng)換液去除懸浮細(xì)胞后，最終可以獲得大量純化的骨髓巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞。

（2）骨髓巨噬細(xì)胞的分離

　　1）取腿骨

　　準(zhǔn)備75%乙醇，小鼠麻醉后，脊髓脫臼法處死小鼠，將小鼠置于75%乙醇中浸泡5min進(jìn)行滅菌消毒處理；

　　轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)，固定小鼠上肢，用剪刀從腹部中線剪開，取其雙側(cè)股骨和脛骨，剔除骨上附著的肌肉和組織（注意：應(yīng)盡量將肌肉組織去除，只留下骨頭，整個(gè)過(guò)程務(wù)必保持股骨及脛骨的完整性?。?/span>

　　將去皮去肉的股骨、脛骨放置在含有75%乙醇的培養(yǎng)皿內(nèi)浸泡5min（注：75%乙醇對(duì)骨髓細(xì)胞沒有影響，但盡量要控制在5 min之內(nèi)），然后用冷的PBS浸泡，洗去脛骨、股骨表面的乙醇，5min。

　　2）骨髓巨噬細(xì)胞提取和誘導(dǎo)

　　將清洗好的股骨、脛骨分開，并用剪刀分別將股骨、脛骨兩端剪斷，使用1-2mL注射器吸取冷的誘導(dǎo)培養(yǎng)基將骨髓從股骨、脛骨中吹出，反復(fù)吹洗3次，直至骨內(nèi)看不到明顯的紅色為止。

　　此時(shí)可能會(huì)有紅色條狀物質(zhì)，這是聚集的骨髓細(xì)胞，用5mL移液槍將含有骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)基反復(fù)吹打，將塊狀的細(xì)胞團(tuán)吹散。

　　然后使用70μm細(xì)胞濾器將細(xì)胞過(guò)篩，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1500rpm/min離心5min，棄上清。

　　加入紅細(xì)胞裂解液重懸，輕彈管底，混懸細(xì)胞沉淀，靜置5min后，加入10 mL 冰PBS進(jìn)行洗滌，4°C，1500rpm/min離心5min，棄上清（必要時(shí)重復(fù)，直至細(xì)胞團(tuán)塊紅色部分明顯減少），用冷的配置好的骨髓巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸，鋪板。

　　細(xì)胞培養(yǎng)期間，每隔2-3天更換新鮮骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基，加入培養(yǎng)基前用PBS清洗細(xì)胞，培養(yǎng)7天后收集細(xì)胞。

注意事項(xiàng)：

　　■ 骨髓巨噬細(xì)胞不可傳代，不可以用胰酶消化，使用時(shí)可用細(xì)胞刮直接刮下來(lái)或者用槍吹打下來(lái)，然后離心計(jì)數(shù)即可用于實(shí)驗(yàn)。

　　■ 建議直接鋪板用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，更換培養(yǎng)容器會(huì)損傷細(xì)胞。

　　■ 細(xì)胞誘導(dǎo)成功后要及時(shí)使用，不宜長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)。

對(duì)于體內(nèi)巨噬細(xì)胞的研究，一個(gè)重要的方法就是使用荷蘭Liposoma公司的Clodronateliposomes氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除單核巨噬細(xì)胞。訂購(gòu)前建議聯(lián)系靶點(diǎn)科技，給出建議后，再聯(lián)系靶點(diǎn)科技訂購(gòu)現(xiàn)貨。