前列腺癌骨轉(zhuǎn)移模型巨噬細胞清除和圈門解決方案

Prostate cancer 前列腺癌 （PC） 。轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性 PC （mCRPC） 是 PC 的最后階段，它對雄激素剝奪療法 （ADT） 產(chǎn)生耐藥性，占 PC 相關(guān)死亡的 90% 以上。恩雜魯胺是第二代小分子雄激素受體 （AR） 拮抗劑，是顯著提高 mCRPC 患者生存率的現(xiàn)代抗雄激素藥物之一。

基質(zhì)細胞形成的腫瘤微環(huán)境提供外源信號以誘導癌癥治療反應，這通常會導致腫瘤細胞的遺傳和表觀遺傳改變的積累。與原發(fā)性腫瘤相比，轉(zhuǎn)移靶向器官在基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì) （ECM） 和細胞因子環(huán)境方面具有不同的組織環(huán)境 。以前的研究表明，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移對化療的反應之間存在明顯差異，這表明癌癥治療耐藥性中涉及轉(zhuǎn)移微環(huán)境機制。事實上，最近的單細胞轉(zhuǎn)錄組學研究支持了這一點，該研究表明，在恩雜魯胺治療后，在患者轉(zhuǎn)移性 PC 中觀察到基因表達變化而不是特異性耐藥克隆的選擇。這表明轉(zhuǎn)移微環(huán)境可能驅(qū)動這些基因表達變化。然而，絕大多數(shù)先前的體內(nèi)轉(zhuǎn)移性 PC 模型 （例如，PC3、C4-2B） 通過腫瘤細胞內(nèi)在機制對抗雄激素產(chǎn)生耐藥性。因此，盡管這些模型可用于研究促進轉(zhuǎn)移的宿主因素，但它們不能用于確定促進抗雄激素耐藥的微環(huán)境因素。轉(zhuǎn)移性微環(huán)境誘導的抗雄激素耐藥的機制基礎(chǔ)和關(guān)鍵的基質(zhì)細胞類型在很大程度上是未知的。

骨轉(zhuǎn)移性 PC 占所有轉(zhuǎn)移性病例的 70% 以上，并且與晚期 PC 患者的死亡高度相關(guān)。在目前的研究中，我們確定巨噬細胞是骨轉(zhuǎn)移性 PC 中顯著富集的關(guān)鍵基質(zhì)細胞類型，與原發(fā)性腫瘤和其他器官的轉(zhuǎn)移相比。使用新開發(fā)的雄激素依賴性骨轉(zhuǎn)移性 PC 體內(nèi)模型，該模型可以區(qū)分抗雄激素耐藥和轉(zhuǎn)移的過程，我們的數(shù)據(jù)揭示了 PC 細胞中巨噬細胞誘導傷口愈合樣反應的新機制，ECM 和受體基因顯著上調(diào)。我們的研究確定了巨噬細胞衍生的激活素 A 通過上調(diào)纖連蛋白 （FN1）-整合素 α 5 （ITGA5） 和酪氨酸激酶 Src （SRC） 信號級聯(lián)反應誘導恩雜魯胺耐藥的重要性 PC 細胞?；颊咿D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中這些關(guān)鍵分子機制之間的強相關(guān)性以及與抗雄激素耐藥和患者生存率的顯著關(guān)聯(lián)進一步支持了這一點。此外，使用新型特異性抑制劑的巨噬細胞耗竭（Clodronate Liposomes，Liposoma）或 SRC 抑制顯著阻礙了骨骼中耐藥 PC 的生長。總的來說，我們的研究結(jié)果闡明了巨噬細胞誘導的傷口愈合反應與轉(zhuǎn)移性疾病中抗雄激素耐藥之間的新機制聯(lián)系，并提出了新的治療方法。

選擇合適的Marker，定義感興趣的巨噬細胞群體，尤其是定義一群新的功能的巨噬細胞群體。Marker的使用和發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。這也是將來發(fā)好的文獻和原創(chuàng)研究重要工作。Iba1 已廣泛用于大多數(shù)巨噬細胞群的染色，肺泡巨噬細胞除外。本研究中，Iba1與模型中的經(jīng)典巨噬細胞標志物 F4/80 共定位。

(H) Macrophage depletion by L-Clod inhibits the development of enzalutamide resistance of PC bone metastasis. Representative images of Iba1 whole-mount staining of bone metastasis samples collected on day 18 with indicated treatment.

(I) FACS quantification of percentage of F4/80⁺ macrophages in total CD45⁺ cells of bone metastasis samples collected on day 18 with indicated treatment.

(J) Representative BLI of mice from H on day 0 and day 18.

Drug treatments

注射方式：靜脈注射

劑量：200ul，濃度是5mg/ml，也就是1mg

多次給藥：是

次數(shù)：6次

時相：根據(jù)模型發(fā)走發(fā)展特點，早期三次，Day0，Day4，Day7。晚期三次，Day11，Day14，Day18。對于慢性模型，需要多次注射，如果有模型里面巨噬細胞的時間曲線圖，比如數(shù)量，功能等評估巨噬細胞的。我們可以精確給藥。如果沒有，建議多參考文獻。

(H) Gating strategy for identification of F4/80⁺ macrophages, CCR2⁺ Inflam-Monos, and neutrophils in bone metastasis.

(I) Representative flow cytometry dot plots showing macrophage depletion using liposomal clodronate, shown as the percentage of F4/80⁺ cells (gated cells) in CD45⁺ total cells.

對于marker選擇，非常重要。比如CD11b，我們需要根據(jù)部位，樣品類型等因素來使用。比如正常肺臟巨噬細胞，我們就選擇CD11c。對于腫瘤樣品，我們一般加上CD11b。正常巨噬細胞的異質(zhì)性，以及腫瘤巨噬細胞TAM的高度異質(zhì)性，讓我們看文獻需要多思考。不能照貓畫虎。